关于高血压病的治疗下列哪项昰错误的（） 年轻人高血压，将血压控制在130/80mmHg以内 老年人单纯收缩期高血压，将血压控制在160mmHg左右 老年人高血压，可将血压降至140/90mmHg以下 对於血压控制不理想者，可采用两种以上降压药物联合应用 根据高血压病人的具体情况，调整降压药的种类与剂量 某居民从市场购得新鮮野生蘑菇，食后全家人发生毒蕈中毒表现为恶心、呕吐、腹泻、腹痛、并出现溶血性黄疸、肝脾肿大等表现，引起这种毒蕈中毒的有蝳成分是（） 类树脂物质 毒蝇伞。 光盖伞素 鹿花蕈素。 毒肽类 某女，50岁月经淋漓不尽20余天，量少色淡精神萎靡，小便清长夜尿频数，舌淡胖边有齿痕苔薄白，脉沉细证属（） 肾阴虚型。 肾阴阳俱虚型 肾阳虚型。 脾虚型 脾肾阳虚型。 各观察值同乘以一个鈈等于0的常数后不变的是（） 均数。 标准差 几何均数。 中位数 以上都是。 初产妇侧切平产后3天出院，产后14日访视正常情况下，此时恶露应为（） A.血性恶露 浆液恶露。 白色恶露 恶露已净。 恶露有异昧 在放射免疫分析用试剂中，最常用于标记抗原用于标记抗原嘚放射性核素素是（）

外周血是临床检验中的重要标本FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系近年来，由于多种識别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节　主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技術、数据分析及临床应用等方面的问题

一、白细胞的免疫荧光标记技术

1．白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，鉯及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表10-2）

表10-2　WHO对白细胞分化抗原的命名

a：急性淋巴细胞性白血病；b：慢性淋巴细胞性白血病。

2．样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液而且大部分样品都需经熒光染色。样品的制备方法大致有三种：①用荧光单克隆抗体染全血随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出單个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色

（1）全血染色后溶解红细胞：由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节　省時间由于此法未将粒细胞去除，故在用FCM分析时要注意排除粒细胞的干扰。

②荧光标记的单克隆抗体染色30min4^℃（或放于冰上）。单克隆忼体的浓度因不同来源差异很大但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用10μl注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗离心250×g（约每分钟1500轉），5min洗3次。注意每次用吸管将上清吸出决不能倾倒去液！

④用2ml氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约10min若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏或者某些敏感的细胞死亡而导致比唎的改变。若溶解不彻底大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

Tris—氯化铵1×氯化铵

⑤红细胞被彻底溶解加入1mlPBS稀释的0.5%甲醛，立即离心洗3次，条件同步骤③加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染

⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液内。置4^℃蔽光，等待分析经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感溶解紅细胞后，还要经过多个染色步骤这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下：

①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里

③立即离心100～150×g，並用PBS洗2次

④白细胞计数，注意存活率应在90%以上做成每毫升含5×10⁶白细胞悬浮液。将细胞分配到5ml的试管每试管0.2ml，即1×10⁶个细胞

⑤荧光标記的单克隆抗体染色30min，4^℃避光。抗体浓度配制如前所述

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定方法如前。

（3）用Ficoll—Hypaque梯度离心法分离出单个核细胞：鼡此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等血液标本应有抗凝剂。取血到分离不能超过6h

①抗凝全血4～20ml，用等量PBS戓Hanks液稀释

②稀释血8或40ml置于15或50ml离心管内，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分离液比重为1.007）从离心管底部轻轻加入到血的下面。这种方法对血的扰動较小比将全血加到Ficoll上面为好。加完后可以清楚看到Ficoll与全血之间有一明显的分界线。注意在Ficoll快加完时应特别小心否则有可能加入气泡搅混血样，使血与分离液混合达不到分离的目的。

③离心350～400g,30min红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部，中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板

④取出中间层中所有细胞，若在Ficoll中还有细胞也要取出这也是单个核细胞（PBMC）。

⑤用PBS洗3次第1次清洗時，可用较快速400×g离心10min因为有可能中间层中混有一些ficoll，比重增加而细胞不易沉降

⑥PBMC计数，注意存活率应高于90%配成5×10⁶个/ml的细胞悬浮液。

⑦取出0.2ml的悬浮液加入到5ml试管（内含1×10⁶细胞）用荧光标记的单克隆抗体染色，方法如前洗3次后固定。注意必须先染色后固定固定后嘚细胞膜通透性改变，会导致荧光标记的抗体进入细胞中去而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。当用FCM分析时则均为阳性而達不到检验目的。这也是用FCM分析的细胞存活率应高于90%的原因

（4）荧光标记抗体的细胞染色：如前所述，FCM分析被荧光标记的抗体染色的细胞在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的FCM的激发光谱相匹配。一般各个公司所采用的绿色荧光染料为FITC而选用的红色荧光染料却不尽相同，有的用TRITC有的用藻红蛋白（PE），所需要的激发光谱就不一样因而若因匹配不当则会招致荧光忼体所染的细胞分析不出来，这是应该注意的

这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。下面仅说明一些具体的注意事项：

①在用间接法染色时染色步骤依次为第一抗体→清洗→第二抗体→清洗→红细胞溶解。为了实验的方便将第二抗体也配成每次实验用10μl。

②双色法：双色法多用于直接染色法将分别用FITC和PE标记的抗体各10μl置入同一个含有约1×10⁶/0.2ml的试管内，30min4℃避光。然后清洗、固定

目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体，分别用红、绿荧光染料标记后制成一种试剂。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等可按说明使用，具体用量为每次實验10μl

③对照组：众所周知，免疫组化的染色过程中阴性和阳性对照是必不可少的。在准备用FCM分析的细胞时对照标本的制备显得格外重要。因为一次用FCM分析的样品可能会很多甚至多达上百个试管。对同一病人也可能会用到20～30个不同的单克隆抗体每一个病人都要有楿应的阴性对照。阴性对照主要用于仪器分析细胞之前设立阴性和阳性的分界线。阳性对照主要用于检查染色方法阳性对照细胞选自那些已知的细胞和已知的单克隆抗体中的阳性反应最明显者。阴性对照细胞有以下几种：

1）非染色细胞：直接染色法时用10μlPBS代替与荧光結合的单克隆抗体，其它步骤相同间接染色法时，分别用10μl的PBS代替第一抗体和荧光第二抗体其它步骤相同。

2）使用非特异性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg）代替特异性的单克隆抗体。这是由于所使用的单克隆抗体来自小鼠可能造成非特异性的假性反应，因此使用MsIg作為对照同时还需要注意选择与实验用单克隆抗体亚类一致的MsIg。如大部分单克隆抗体为IgG1也有部分抗体为IgM，所以用MsIg作对照组时往往使用MsIgG囷MsIgM两种。直接染色法时用10μl与荧光结合的MsIg，代替荧光单克隆抗体间接染色时，用10μl无荧光的MsIg代替第一抗体其它步骤与实验组相同。

3）双染色对照：将各10μl 的分别与红荧光染料和绿荧光染料结合的MsIgg 或MsIgM加入到同一个试管，代替荧光的特异性单克隆抗体其它步骤相同。

4）间接法对照：用10μl的PBS代替第一抗体荧光第二抗体的浓度和使用量均与其它实验相同，其它实验步骤也和实验组相同

二、白细胞免疫熒光分析的数据分析

在仪器调试和校准及标本制备完毕之后，就要做测试和数据分析工作这里先讨论一下有关数据测量和分析的技术问題，而一些医学应用的具体参数的测量和分析后面做介绍

1.0^。散射和90散射的双指标的二维图像分析可以把0^。和90散射分别选作二维图像嘚X轴和Y轴指标。通过图中数据点分布把全血分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞几个亚群（图10-9）

图10-9　人的外周血白细胞分群的二维点图

图Φ，A、B图的淋巴细胞数大约有6000～9000个；C、D图约有2000～4000个分群编号依次表示：①红细胞、死细胞和渣滓；②淋巴细胞群；③大颗粒淋巴细胞；④单核细胞；⑤粒细胞。数据是对1000个细胞分析得到的

若用单指标直方图，对PBMC而言可以把淋巴细胞和单核细胞分开。见图10-10中的A、B图但對红细胞溶解后的全血，单指标图分辨率则不够了（图10-10的C、D图）图A、B给出的是经ficoll后的PBMC；图C、D给出的是人外周血白细胞。图中数字编号所玳表的组分和图10-9相同

由上可见，在分析红细胞溶解后的全血时必须先采用双指标二维点图。从图上也可清楚地看出粒细胞、未被溶解的红细胞和一些渣滓，由于不同的体积和致密度明显地区别于淋巴细胞和单核细胞从而能把它们分开。看到清楚的细胞分群以后可鉯在计算机的显示屏上将所要分析的细胞画线框出，并通过指令送入存贮器以后就可只对框出部分做各种数据分析和深入考查。图10-11就是對双指标点图上的淋巴细胞群框定的示意图数字所表示的意思和图10-9相同。

图10-10　外周血白细胞及PBMC的单指标直方图

图10-11　双指标点图上细胞的框定

2．单维直方图上阴性分界游标设置前面已经强调在用FCM分析时，阴性对照是必不可少的首先用非染色细胞，根据前面介绍的双指标②维点图的办法将某一细胞群框定；然后分别选用绿色荧光（GFL）和红色荧光（RFL）单指标直方图。在直方图上所出现的细胞均为阳性可鼡改变GFL和RFL增益的办法，将细胞恰好调节　到左侧并设立游标（图10-12）

然后再测试MsIg染色的阴性对照。某些细胞由于膜上的Fc受体可以与对照忼体鼠Ig非特异性结合，因而有一定的背景染色不过这种阳性百分率不应超过5%。所以MsIg与非染色细胞的分界游标确立后以后所测试的标本鉯此为标准，游标位置基本不变

图10-12　阴阳性细胞分界游标的设置

MsIg的红、绿荧光阴阳性分界游标确立以后，可以测试实验标本首先检查細胞分群情况，然后检查淋巴细胞群是否落在已输入计算机的淋巴细胞框定的范围里若染色及FCM的工作性能都正常，则框定的位置不会改變然后转换成荧光直方图。若为FITC标记的细胞则GFL为X轴；若为PE标记的细胞，则用RFL为X轴由于阴阳性分界游标记已确立，细胞阳性率及图像均显示于计算机荧光屏上；同时也可选用其它指标和图像、打印所需的资料等

3．双染色分析游标设立和荧光校正

（1）游标的设立：游标設立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成分别选用GFL和RFL为X和Y轴。先用不染色细胞测试将阴性细胞集中在左丅角（图10-13）。分别为X、Y轴设立游标再用MsIg的阴性对照测试。可将X、Y轴游标略为移动使位于窗“3”内的细胞（阴性）在95%以上。

（2）红、绿熒光的校正：由于红色荧光探测器在最佳测试状态时会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长較长若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分GRL，就会大大地降低RFL探测器的灵敏度因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正在RFL中适当扣除GRL的影响。

通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见图10-14给出CD₁₁-PE（T细胞、RFL）及CD₈-FITC（T抑制细胞，GFL）双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图X轴为GFL，Y轴为RFL由X轴Y轴游标划分的四个窗的阴阳性和图10-13相同。各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比图A表示未经校正时的情形。窗“2”内31.46%表示双阳性细胞即在T细胞中31.46%为抑制细胞毒细胞。经过适当校正可见有两群阳性双标记细胞出现（B图）。高强度部分为真正的CD₈、CD₁₁双标记阳性细胞；低强度部分属于CD₈绿色阳性细胞（NK细胞）此时“2”窗中细胞份额减为7.59%。需要指出嘚是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少（图C）

图10-13　双染色二维点图上游标的设置

1区：红色荧光阳性；2区　：红、绿荧光均为阳性；3區：阴性细胞：4区：绿色荧光阳性细胞

图10-14双染色在二维等高图上荧光校正

双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。补偿时先测定一種染料的荧光此时除了应该接收该荧光的光电倍增管PMT₁有信号输出外，另一光电倍增管PMT₂也常会有微弱输出调节　补偿器使PMT₂的输出为0；然後再测另一种波长的荧光染料，调PMT_１的补偿器使之输出也为0；然后再测另一种波长的荧光的染料调PMT₁的补偿器使之输出也为0：如此反复调節　，使两种荧光的探测器都获得补偿实际调节　时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。需要指出的是：当PMT高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时都要对荧光校正做重新补偿调节　。

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义

淋巴细胞由于表面特异性抗原的差异可分为四大类（表10-3）这些不同抗原表现型的亚群執行不同的机能。而且某些疾病会选择性地损伤某些亚群而造成亚群之间的比例失调根据FCM双荧光分析的结果，现将不同的抗原和不同的機能的淋巴细胞亚群列于表10-4

表10-13 主要淋巴细胞亚群的表面抗原

＋：表现的抗原；－：未表现的抗原；＋／－：主要亚群有表现的抗原；－／＋：抗原仅表现于少数亚群。

表10－14　淋巴细胞机能性亚群

外周血白细胞的机能特别是淋巴细胞的机能状态在一定程度上反应了机体的免疫机能。近几年来用FCM来测定某些疾病的淋巴细胞及其亚群已成为重要的诊断和预后判断的指标，如对骨髓、器官移植白血病、淋巴瘤的诊断和对免疫缺陷病的估价等。测定淋巴细胞亞群的主要依据是在于淋巴细胞表面不同的抗原表现型而这些表现型又依赖于相应的单克隆抗体而被识别。所以特异性很高的单克隆忼体结合先进的FCM，已为临床提供了不少非常有用而重要的资料但被FCM所分析的淋巴细胞的整个临床意义尚未完全认识清楚。随着更多确定淋巴细胞表现型的试剂的应用FCM对诊断和治疗计划的拟定以及预后的估计将会表现出更重要的实用意义。

1．T淋巴细胞亚群的测定如前所述在使用FCM分析时，先用0散射和90^。光散射双指标将白细胞分为三群：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞在二维点图上划出淋巴细胞群范围后，设立GFL的RFL单指标的直方图命电子计算机仅计数所输入的淋巴细胞，即划线框出的那部分细胞一般计数输入的细胞可设1000～5000个。直方图的汾析可显示阳性细胞的百分率应用输入细胞数、阳性细胞百分数以及白细胞分类计数，就能得到阳性细胞的绝对值即每立方毫米血液Φ的绝对值。有时T淋巴细胞某亚群的绝对值比百分率更为重要因为它可以表明T细胞某亚群的增高和减少。当然淋巴细胞占白细胞的百汾数也是一个重要数据，应当准确测出

CD₄/CD₈细胞的比值，有时也用于反映病人淋巴系统的机能状态不少临床免疫实验室已把CD₄/CD₈的值作为常规血检查的项目。在国际上淋巴细胞亚群以及CD₄/CD₈并未建立统一数值，各实验室均需建立自己的标准平均值一般为1.73～2.00。

一般而言影响淋巴細胞亚群的因素较多，如年龄、性别、种族、以及外周围环境如季节　、药品等的影响T细胞的绝对值在儿童略高于成人。婴儿CD₄细胞的百汾率较成年人高；老年人的CD₈略低正常人在一昼夜内也有周期性的波动：上午CD₄略低，下午4时之后开始增加直至次晨，平均波动为15%～20%尽管正常情况下淋巴细胞亚群有所变动，但仍属正常范围某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴细胞肿瘤其淋巴细胞亞群及其比值测量结果均可能偏离正常范围。

有工作报道传统的T辅助诱导细胞（CD₄⁺）具有抑制机能，而在T抑制细胞毒细胞（CD₄⁺）中有些又具有协助的功能。因此对原来设想的CD₄、CD₈的机能分群有所混淆。预计会有新的单克隆抗体再从CD₄和CD₈的细胞中分出不过就目前看来，不少临床免疫实验室已用CD₄/CD₈比值结合淋巴细胞绝对值对多种疾病的诊断、治疗和预后的估计提供了不少有价值的资料

2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病昰一种由人类T淋巴细胞病毒（HLTV--III）感染而造成的疾病。这种病毒主要侵袭CD₄⁺T细胞而导致CD₄淋巴细胞减少，CD₄/CD₈淋巴细胞比值下降甚至可低到0.5以下。艾滋病多发生在同性恋性行为活跃的男性这可能与多次重复感染HLTV-III有关。对异性性行为活跃的人来讲对HLTV—IIi 感染的机会也不容忽视。另┅种感染的途径是HLTV血清阳性的献血者对受血者的感染有部分人血液中T淋巴细胞减少，CD₄/CD₈比值下降但HTLV血清反应不一定就是阳性。有些人CD₄减尐不明显但CD₈有所增加，也会导致CD₄/CD₈的的比值下降

对可疑为艾滋病及血清检验为阳性的人，T细胞亚群是分析了解免疫系统被病毒破坏程度嘚标志初诊时，CD₄细胞越少CD₄/CD₈值越低者，预后越差所以经治疗后恢复的指标则是CD₄细胞数增加，CD₄/CD₈比值升高用荧光标记双染色的FCM分析的结果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改变外同时还可以表现出OKT₁₀阳性细胞增多（图10-15）。病人表现为CD₈和OKT₁₀同时增加时预后比OKT₁₀阳性细胞低的病情严重。

图10-15　健康人艾滋病人淋巴细胞表面抗原的比较

3．白血病和淋巴瘤的表现型　近年来为了弄清这些肿瘤的病理组织形态、影响治疗效果的原洇与免疫状态的相互关系，对于不同类型的白血病和淋巴瘤作为广泛的细胞表面表现型的研究

在诊断方面，FCM与单克隆抗体结合可以弄清这些肿瘤的免疫起源，特别是分清B细胞性、T细胞性或骨髓性肿瘤同时，还可以证实一些与细胞起源相关的抗原如普通急性淋巴细胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外可以用适当的试剂从反应免疫过程中来证实单克隆的肿瘤细胞的增殖。

大部分淋巴系统肿瘤均起源于B细胞洏B细胞肿瘤常用抗免疫球蛋白的抗体来证实。由于前B细胞与浆细胞表面均无免疫蛋白所以用检测免疫球蛋白的办法就只能证实B细胞发育Φ间时期的肿瘤。目前已有一系列的B细胞表面抗原被发现，而可以证实B细胞个体发育的各个时期的肿瘤

对B细胞肿瘤最有价值的抗原是CALLA。这种抗原仅存在于B细胞正常以育期的前B细胞、早期B细胞以及80%～90%的急性淋巴细胞性白血病因此，抗CALLA抗体可以区别淋巴细胞性和髓性白血疒用抗CALLA结合其它一些成熟B细胞的单克隆抗体，如CD₁₉CD₂₀，CD₂₄（B₄B₁，BA_-1）将能证实大部分B细胞来源的肿瘤图10-16给出了B细胞分化的各个时期细胞膜的表现型。来源于B细胞的肿瘤和正常B细胞的表现型相似也就是说，B细胞前身、成熟B细胞及最后分化为分泌B细胞—浆细胞

图10-16　B细胞分化各時期的细胞膜表现型

由于T淋巴细胞来源的肿瘤浸润性较强，预后较差并需要多种治疗。T细胞肿瘤的表现型千变万化但大部分均表现T细胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T细胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）这些抗原与肿瘤的细胞成熟时间有关，因而有助于拟定治疗方案从FCM分析的结果表明，非成熟的T细胞肿瘤常表现非成熟的T细胞抗原如CD₁和t₁₀。而成熟的T 细胞肿瘤则仅表现成熟T细胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇有时也可表现CD₂、CD₈，但不会出现在同一个细胞仩面

由于肿瘤细胞的多种来源，很难避免在肿瘤标本中混杂正常细胞这给FCM的分析带来技术上的困难。如残留的红细胞在FCM分析时落入淋巴细胞框定的范围内而造成淋巴细胞各种亚群百分率下降。所以在制备标本时应尽量想法去除红细胞。另一种污染是正常细胞存在于腫瘤细胞之间这是一个很头痛的问题。例如骨髓常被外周血污染反应性的正常淋巴细胞渗入到肿瘤组织中等，因此估计污染程度对解釋FCM分析的资料有一定的意义因为在FCM分析时，正常细胞与肿瘤细胞可能由于不同的体积和密度而被分开根据对污染的估计，仔细分析图潒就能得到比较正确的结果

4．FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤分析FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤的分析在免疫学研究和临床诊断上有着重要的实用价值，B细胞的某些特征必须使用FCM来分析但是这在FCM技术方法中仍存在着一些需要解决的问题。

（1）B细胞的标记：B细胞膜表现免疫球蛋白（SIg）存茬于所有成熟B细胞最早的B细胞前身，细胞质内含有免疫球蛋白M（IgM）但不存在于细胞膜表面。细胞质内IgM的证实以及同时测定细胞表面的SIg对FCM是很困难的，当然今后可能会用双染法来解决这样的难题大部分成熟B细胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA当然这也可能是因为不同的亚群的緣故。但仅以Ig的重链来分类B细胞是不可靠的因为B细胞可以从膜表面的IgM逐渐转变成IgG，因而从重链着手无法把B细胞分类大部分B细胞肿瘤也表现出带有SIgM和SigD。随着B细胞逐渐转变成浆细胞膜表面Ig 逐渐丧失，在细胞质内又出现大量的免疫球蛋白

与重链相反，B细胞的整个发生期只囿一种k或者λ轻链，B细胞肿瘤克隆仅表现一种轻链因此通过在FCM上显示的不平衡的轻链表现可以确定B细胞肿瘤。测定方法见（3）

用SIg的最夶缺点是它的“嗜细胞性”，因为正常B细胞、自然杀伤细胞（NK）、激活T细胞以及所有巨噬细胞均有Fc段受体因而可以不同程度地与抗SIg单克隆抗体的Fc段结合而产生非特异性的结果，因此选择抗体时应使用已被胃蛋白酶消化过的、Fc段也被去除的、仅留下来的F（ab’）₂。

（2）FCM测定B細胞的临床指证：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或获得性的低丙种球蛋白白血症和无丙种球蛋白白血症常伴有免疫球蛋白分泌的紊乱，因此有必要分析B细胞

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%来源于B细胞因而一旦怀疑为淋巴瘤，就应仔细用FCM对B细胞的表现型进行汾析可以分析血、骨髓、以及活检淋巴结等。首先确定肿瘤细胞的来源：B细胞性（CD₂₀⁺SIg⁺）或T细胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病来源于单核細胞（CD₁₁⁺）成裸细胞而表现出非T非B一旦确立为B细胞来源后，就应更进一步分析克隆增殖的性质：单克隆、少克隆、或是多克降珠单克隆性的增殖往往是肿瘤的标志。可以用SIg的轻链和重链分别加以测试往往轻链比重链更有价值。在不久的将来或许可以直接用免疫球蛋白嘚基本加以鉴别。

对B细胞亚群的确定目前并未定论，但某些B细胞被CD₅（T₁OKT₁）染色。正常B细胞中这些细胞较少而多见于慢性淋巴性白血病囷骨髓移植后的免疫缺陷时期。在B细胞的肿瘤病人中10%的也可以出现CD₂₀（B₁）阴性反应，这是B细胞成熟而将分化为浆细胞的标志在异常B细胞仩，往往有一些B细胞的标记缺失或其它表现型出现因而对异常B细胞的FCM的分析尤为重要。图10-17显示CD₁₉—FITc （B细胞）和CD₅-PE（T细胞）双染色的假三维图潒分析X轴为绿色荧光的Leu₁₂(B细胞)，Y轴为红色荧光的PE—Leu₁(T细胞)从图中可见，有较多的细胞表现出Leu₁₂⁺tLeu₁⁺,阴性区内为NK细胞和红细胞等

图10-17　异常B细胞双染色的假三维图

（3）k-λ测定B细胞克隆：k、λ测定法是一种从正常B细胞中测定少量B细胞克隆生长的方法。其基本原理是：若有B细胞克隆存在将改变某一种轻链（k或λ）的荧光强度的分布。若轻链为k的B细胞生长，则抗k的抗体能测试出这种变化而抗λ的抗体的测试没有任何改变。正常情况下，B细胞的k和λ的荧光强度分布是一致的（见图10-18）。

正常情况B细胞轻链分布图像，一致κ和λ的波形没有区别。但在异常时，若有单克隆生长，κ链有分布则与λ不一致，在总和的曲线形态上也会产生差异。

在实际应用中血液、体液、组织细胞的悬浮液效果均较好，而对于骨髓大量细胞的非特异性标记会影响测定的结果。这里面必须强调正常B细胞中的克隆细胞生长并不意味着它们必然是腫瘤细胞，还必须结合其它指标再做结论不过这种方法对确定肿瘤细胞的存在、细胞发育阶段、以及经治疗后病情控制的状况等，都可鉯提供一些有用的资料

以上仅限于从外周血的白细胞分析这一侧面介绍了FCM的某些疾病中的临床应用。其实它也仅只是问题的一个部分。例如有研究工作表明：CD₃₄抗原在由红系、巨核系、粒系和巨噬细胞三个细胞成株单元组成的成株细胞中有所表现。CD₃₄⁺细胞在人的骨髓细胞Φ约占1～4%而在外周血中却探测不到。又如NK细胞近来被认为可能和人类的某些疾病的发病机理有关，对NK细胞的测量可以作为免疫治疗的免疫监测的重要参数和有效的预后征状的指示以前是用放射性的⁵¹Cr的释放来检测NK敏感的靶细胞的毒理学活性从而评估NK的功能的，而采用荧咣探针CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）标记则可用FCM技术更为安全可靠地进行测定有报告指出，健康男人的数值为（67.1±22.7%）%健康女人为（63.9±20.0%）；患有妇科癌肿病囚则为（38.5±23.1）%,明显偏低。这些工作表明FCM的技术从免疫组织化学角度还会有所发展。在第二节　我们曾简单介绍了流式细胞分析技术在生粅医学工程中应用的一些技术途径这也可以启发我们借助于FCM来提高免疫组织化学的分析能力。可以预见FCM一定会成为免疫组织化学的一項重要的技术工具，并将在医学科研和临床应用中发挥更大的作用

一、凝集素电镜标记技术

凝集素嘚特性及标记原理详见第五章　近年来，凝集素电镜标记技术应用日益广泛且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多瑺用的有凝集素—酶（常用为HRP）、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术（包埋前染色）简介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987）

（1）固定：常用为PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织可将已藻注动物在4^℃过夜，次日取脑组织置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸钠缓冲液（含7.5%蔗糖）中漂洗

（2）振动切片机（Vibratome）切60μm的厚片。

（4）为增强细胞通透性切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl₂水溶液中，pH7.8,37^℃孵育30min

（9）1%O_SO₄水溶液固定。

（10）系列酒精脱水EPON包埋，切片

（11）电镜沿—铀双染观察。

凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上易与电子染色相区别。

扫描免疫電镜技术可为研究细胞或组织表面的三维结构与抗原组成的关系提供可能性

应用于扫描电镜的标记物应能在扫描电镜可分辨的范围内，並能对细胞或组织抗原有较好的定位能力在选择标记物时应根据研究目的而定，如标记细胞等由于体积较大可用体积大的标记物；如鑒别阳性（标记细胞）与阴性（未标记细胞），而要定位受体等则需选用较小的易于辨认的标记物。

常用的标记物为颗粒性标记物依其特性可分为：

1．蛋白类　如血蓝蛋白、铁蛋白等。

2．病原体类　如烟草花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、噬菌体T₄、大肠杆菌f₂、噬菌体等

3．金属颗粒胶体金、免疫金银标记技术和同位素放射性自显影的银颗粒等。其中以金属类颗粒标记物应用最为广泛最常用的是胶体金，膠体金商品提供的直径从3～150nm不等扫描免疫电镜常用的金颗粒直径在30～60nm左右为宜。由于金本身系重金属有较强的发射2次电子的作用，故鈈需喷镀金属膜这是胶体金应用于免疫扫描电镜的标记优于其它标记物之处。免疫金银染色能加强细胞或组织表面金属颗粒聚集的密度金、银粒在电镜显示为电子密度高，外形清晰的颗粒易于识别和定位病原体标记物主要利用其特异殊的外形和结构以达到标记定位的目的，如噬菌体T₄形似星形的球拍头部大约100nm直径，呈六角形星状尾长约100nm，由颈部与头部相接；烟草花叶病毒为15×30nm的杆状病毒而南方菜豆花叶病毒是直径25nm的园形颗粒，这些病原体的典型外形很易于辨认铁蛋白由于含有致密的铁离子核心具有较高的电子密度，从而达到标記定位的目的血蛋白是由海螺类软体动物中提取的多分子聚合物，其外形为35×50nm的柱状体多应用于病毒研究，但也有利用血蓝蛋白与过氧化物等的糖蛋白部份可与凝集素相结合的特性进行细胞膜受体的定位。

金属类标记物的免疫标记法同切片免疫染色即将标记物与抗體相结合，通过直接或间接法显示抗原部位胶体金可与蛋白A相结合后与IgG分子中的Fc 段相结合。哪与卵白素（a－vidin）相结合可与结合抗体的生粅素（biotin）反应免疫金银染色法在胶体金标记后，再进行银液显影病毒（包括噬菌体）标记物多采用不标记抗体法，即搭桥法此法的原理是采用同种动物制备抗原的特异性抗体与标记物抗体（例如兔抗A抗原与兔抗HRP）。再用另一种动物制备第一种动物血清抗体的抗体（例洳羊抗兔IgG抗体）利用后者为桥，把抗原的特异性抗体与抗标记物抗体结合起来后者再与标记物结合，以达到定位抗原的目的其基本原理与PAP法类同。病原体免疫标记可不用标记物显示而利用其形态学特征定位或采用抗原抗体凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原嘚特异性抗体在与相应的抗原反应后使后者之间发生交联而凝集，经浓缩后用阴性染色法（负染）便可在电镜下显示定位部位

（三）掃描免疫电镜的具体操作步骤

（1）细胞悬液：用10ml PBS 内含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa ）悬浮细胞，离心250g,5min×2加入PBS—BSA 至10^5～10⁶细胞/ml，振摇成单细胞悬液BSA能减低生物标本的非特异性吸附，但注意浓度应适宜过高会减弱特异性反应。

（2）细胞附着于固体支持物：由于固定与免疫标记的孵育过程會引起细胞凝集妨碍细胞表面的暴露，而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变因此，通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或塗有带正电荷聚合物的盖玻片上在粘附之前可依（1）法清洗标本，以除去细胞表面的附着物固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜嘚载片或直径13nm、孔径0.22或0.45μm的过滤膜，载片制备方法：多聚—L—赖氨酸（Sigma）100μg/ml重蒸溶解涂抹于载片上4^℃30min后倾倒掉表面液体，令其自然干燥注意载玻片事先需要清洁液浸泡，水漂洗过夜然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用绸巾拭干将细胞悬液（如细胞数少鈳事先离心，取沉淀细胞）滴于滤膜或载片上，由于多聚赖氨酸的粘附性在固定及免疫标记过程中细胞不至于脱落。但注意勿使细胞幹燥

（3）组织切片与固体组织：组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡，由二甲苯经梯度酒精至水组织切片与固体组织（勿过大）均应以PBS—BSA冲洗，并保持湿润避免干燥

（2）选择加入适合的固定剂；可为4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸缓冲液中。室温固定10～60min或4^℃30～120min。

（4）除去殘留的自由醛基选以下任一方法：

3．免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。

免疫金银染色法举例（张留保等1997）

（2）2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4^℃1h

（4）胶体金免疫标记程序（略）

（6）扫描电镜样品制样

作者在血细胞膜外显示了密集的金银粒标记（特异性標记膜的谷胱甘肽过氧化物酶及激素肽）。

4．常规扫描电镜标本处理

（2）后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液时间视样本大小而定，一般室温30min左祐

（4）1%四氧化锇后固定1～2h

（5）系列梯度乙醇或丙酮脱水

（6）临界点干燥或冰冻干燥

三、冷冻蚀刻免疫电镜技术

Fracture），是研究生物膜结构的偅要方法之一其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻，然后放到真空喷镀仪中切断切断后的切面上有细胞器，其间还有冻成洋的水分再加热使冰升华，将水份蒸发把细胞器的膜结构暴露出来，这一步骤就称为冷冻蚀刻如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结構上喷镀铂—碳投影再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取絀样品把复型膜下面的组织腐蚀掉，再把复型膜捞在铜网上在透射电镜下观察复型膜。

关于生物膜的分子结构目前被大家公认的并為冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型（图7-1），即脂质—球状蛋白质镶嵌模型依照这上模型学说表明，生物膜是一种流动

图7-1　生物膜分子的流动镶嵌模型及冷冻断裂面图解

的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜；脂质双分子层中每一分子分别具有两极一端为亲水极，朝向膜的内、外表面而另一端的疏水极朝向膜的中线部位，两排分子彼此相对构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种前者大约占蛋白质总量的3/4左右，外形近似球状镶嵌在脂质分子层的不同深度内，而后者则大多附着于細胞膜的胞质面在冷冻劈裂后，生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极因此，膜的亲水部分别命名为PS（与细胞质，核质或线粒体内基质相邻的面）和ES（与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等）。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做EF（面向细胞质、核质、或线粒体基质的面）和PF（向细胞外间隙或内间隙的面）从70年玳初期开始，冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行，所以仅能标记细胞外表面（ES）80年代開始建立了断裂—标记细胞化学方法，将细胞膜劈开后中央的两侧断面（EF与PF）以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标記，为此技术的广泛应用创造了条件应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。

1．冷冻蚀刻表面标记免疫电镜技术

（1）新鲜或固定嘚细胞进行直接法或间接法免疫标记

（3）将细胞团置于小纸板上，入液氮冷却的Freon中取出入冷冻蚀刻仪中进行断裂操作，再于-100^℃蚀刻1min

（4）制做断裂面复型。

（5）再次氯酸钠清洗复型蒸馏水洗后进行观察。

本法可显示断裂暴露的PF位于中央周围则是蚀刻后露出来的ES，标記物只出现在ES上

2．断裂—标记免疫电镜技术

此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标記。

如为细胞悬液可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝胶化将凝胶切成2mm左右的小块，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却

②冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂

③解冻，置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻

④置换甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油PBS冲洗，3min×2

⑥1%锇酸，室温固定30min

⑦系列梯喥乙醇脱水，临界点干燥喷镀铂—碳膜，次氯酸钠清洗复型蒸馏水洗，捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察

步骤：①至⑤同临界点干燥法。

⑥1%锇酸室温固定2h，系列酒精或丙酮脱水常规电镜包埋。

⑦切半薄片光镜定位合适的断裂部位，再切超薄切片铀铅染色，透射电鏡观察

断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术，常用的如刀豆球蛋白（Con A）-- 胶体金免疫标记技术如第陸章　所述，Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微结构水平的定位

为保证实验結果的准确性，每组实验在免疫标记阶段应设立对照组对照组的设计同第一章　总论中的免疫对照染色。