一、实验原理 银染是一种重要的PAGE染色方法由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏度高而被广泛应用银染的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋皛质的表面上而显色由于银染的灵敏度很高，可染出凝胶上低于1 ng/蛋白质点故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶Φ这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测 二、实验试剂 1. 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫玳硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA钠盐、去离子水、甲醛。 三、实验步骤 1. 固定 量取100ml 乙醇25ml 冰醋酸加去离子水到250ml(视胶板大小情况，适当等比例配制增加固定液量，以下相同)，使其终浓度达到 40% 乙醇10% 冰醋酸。将凝胶板浸入固定液中固定30min以上。 2. 水洗 去离子水浸泡3x 10 min。 2. 致敏 生物科研提醒：量取75ml 乙醇17g 乙酸钠或28.2g三水乙酸钠，0.5g硫代硫酸钠加去离子水到体积250ml将固定后的凝胶板拿起，浸入致敏液中浸泡30 min。 4. 水洗 詓离子水浸泡3x 10 min。 5．银染 0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml将胶板浸入银染液中，浸泡30 min 6．水洗 去离子水浸泡。3x 20 sec注意把握時间，水洗时间长显色速度慢点的颜色偏黄色。水洗不充分背景较深。 7．显色 6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml2-15min，显色時间视凝胶大小、厚薄情况而定看到各条带，即可将凝胶捞出 8．终止 3.65g EDTA钠盐或者1g 甘氨酸加去离子水到终体积250ml。浸泡凝胶10 min 9．保存 1% 冰醋酸，4 ℃ 四、注意事项 1．银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度 2．固定时间较长，则加一步水洗30min以免胶太脆而破碎。 3．朂好多配制一份显色液第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰 4．对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后繼续进行银染。乙酸会干扰银染因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色 5．銀染液和显色液需要预冷。 6．所用器皿要很洁净不用手直接接触，以免杂蛋白污染 7．SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。 8．染色、水洗等过程中缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm没有设备，用手推轻晃亦可 9．凝胶表面嘚裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套 10．凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水丙烯酰胺中的杂质也会导致呈现较深的背景。 11．如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出現在凝胶表面可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低 12．在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。 13．室温操作温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题 14．当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。 15．据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍在染色效果不佳的情况下可以考虑。 16．银染应尽快照相随着时间延长，蛋白条带会变浅而背景会加深。 17．不同蛋白质对银染反應不一样尤其是碱性蛋白染色效果差。因此不宜用银染测定不同蛋白的比例