赤ん坊だった頃のマリオとルイージは、コウノトリに運ばれて2人の両親の家に届けられようとしていたところが、この双子はカメ一族の魔法使い?カメックの占いによって、のちにカメ一族の脅威となることがわかったため、カメックはこの双子の赤ん坊を強奪しようと企んだ。カメックはコウノトリを襲ってルイージを奪うことはできたが、マリオはヨッシーたちの住む島「ヨッシーアイランド」に生息する1匹のヨッシーの背中に着地そして、ヨッシーたちがこの赤ん坊についてどうしようかと会議しているところ、マリオが「あっち、あっち」と指差し始めた。そこでヨッシーたちは、ルイージを救って2人の赤ん坊を無事に両親のもとに送り届けるため、マリオを交替で運びながらこの赤ん坊の指差す方向に向かい、冒険をすることになった
本作は『スーパーマリオワールド』を含めたマリオシリーズよりも前の時間軸。主人公となるのはヨッシーたちであるマリオシリーズの実質的なエピソード1とも呼べる作品で、マリオがヨッシーと出会い、共に冒険をしてルイージを救い出し、二人そろって無事に両親の元へ届けられるまでが描かれる。