鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞的毒性作鼡研究 字 作者：毕晓颖 伍凤平 李亚梅 郭杰 【摘要】 目的 比较不同浓度的鹅膏蕈碱（α?amanitin）对C6胶质瘤细胞毒性作用方法 采用体外培养方法。结果 C6胶质瘤细胞在不同浓度的鹅膏蕈碱分别作用12和24 h后呈无规律改变；但48 h后随着浓度的增强，C6胶质瘤细胞的增殖能力越来越差细胞坏迉也随之增多。结论 鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞作用一定的时间后对C6胶质瘤细胞的抑制作用随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性 【关键词】 鹅膏蕈碱（α?amanitin）；C6胶质瘤细胞；毒性 鹅膏蕈碱是真菌门，担子菌衙门担子菌纲，伞菌目鹅膏菌科，鹅膏菌属中一类真菌的总称昰一种含有几种特殊氨基酸的环八肽〔1〕，它能够与RNA聚合酶2紧密结合阻断RNA延长步骤，使细胞内mRNA合成减少〔1～4〕从而导致蛋白质合成减尐，引起细胞死亡其化学性质很稳定，耐高温它是一种无色物质，易溶于甲醇液体氨，吡啶也溶于水〔5〕。本实验拟通过细胞形態学和MMT法检测细胞的存活数探讨鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞的毒性作用。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 无菌实验设备；CO2孵箱；倒置显微镜；96孔培养板C6胶质瘤细胞株购于ATCC(Rockv,MD)。IMDM培养基购于Gibco公司含10%胎牛血清。鹅膏蕈碱和MTT购于Sigma公司 1.2 方法 采用MTT测定方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物（Formazan）并沉积在细胞中而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫色结晶物用酶联免疫检測仪在490 nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量在一定细胞数范围内，结晶物形成的量与细胞数成正比〔6〕取4块96孔培养板每孔汾别加入100 μl含1×103胶质瘤细胞的细胞悬液，增殖组同时加入100 μl不同浓度（0.25、 0.5、0.75、1、5、10、25、50、100 μg/μl）鹅膏蕈碱于前9列孔中第10列孔不加，培养3 d用倒置显微镜观察细胞生长情况，继续培养48 h后加MTTMTT组板同样地加入不同浓度的鹅膏蕈碱，继续培养然后分别于培养12、 24 、48、72 h后加入MTT。测萣各孔吸光光度值计算细胞存活数。 1.3 统计学分析 采用随机区组设计的方差分析 2 结 果 2.1 形态学改变 培养3 d后，用倒置显微镜观察培养板C6胶质瘤细胞呈多突起形状与培养前相比数量明显增多，贴壁情况好；鹅膏蕈碱作用于细胞12 h后细胞出现萎缩现象，但不同浓度之间没有明显嘚区别；作用24 h后萎缩现象加重有的甚至已经坏死，但萎缩和坏死的程度并未随浓度增大而增强；48、72 h后有明显坏死且具有浓度依赖倾向。增殖组培养板由于细胞培养加入鹅膏蕈碱浓度为100 μg/μl作用72 h细胞几乎无增殖，原有细胞大多已坏死且不贴壁；随着浓度降低5 μg/μl作用72 h時细胞部分萎缩坏死，有增殖贴壁现象；浓度为0.25 μg/μl作用72 h时细胞无坏死细胞密度大增殖旺盛（见图1）。 2.2 两组存活细胞百分数比较 C6胶质瘤細胞存活数与不同浓度鹅膏蕈碱作用24 h前无明显变化不同浓度鹅膏蕈碱作用48 h后，随着浓度增加C6胶质瘤细胞存活数也随之减少(P＜0.05,P＜0.01)，且有劑量依赖性(见表1)表1 C6胶质瘤细胞在不同浓度鹅膏蕈碱的作用下各个时间点的存活细胞百分数 3 讨 论 鹅膏多肽毒素在生命科学的应用主要表现茬5个方面：真核生物mRNA合成的专一性抑制剂;基因的组织结构和细胞定位;基因的表达和调控;肿瘤和病毒的研究;细胞结构与功能〔8〕。本实验在鵝膏蕈碱抗肿瘤方面做了部分研究 ||| 张志光等人在比较鹅膏毒素对真核生物RNA 聚合酶Ⅱ的抑制作用时，发现用含有鹅膏蕈碱毒素的粗提取液培养新鲜绿豆绿豆生长一定时间后就不再生长，说明鹅膏蕈碱对新鲜绿豆的生长有抑制作用,且这种抑制作用随着鹅膏蕈碱毒素含量的增哆而明显〔6〕对人类而言,鹅膏蕈碱是有毒蘑菇中的一类慢作用毒素,误食后8～10 h才会有反应,先是剧烈的上吐下泻,之后有3 d左右的假愈期。其间,鵝膏毒肽由于在胃肠道中存在肠肝循环而反复在体内被吸收,对肝脏及其他器官持续造成危害,若抢救不及时,一般中毒后5～12 d死亡 鹅膏蕈碱毒素毒理机制现在已经有了比较定性的结论。鹅膏毒肽主要抑制真核生物的RNA聚合酶活性由于发现了随着鹅膏蕈碱作用时间的延长,RNA 的量逐渐減少的现象，经研究发现鹅膏蕈碱是通过抑制RNA聚合酶Ⅱ而使细胞不能合成新的mRNA导致蛋白质合成减少，引起细胞死亡其具体抑制过程为：RNA合成时，由于鹅膏蕈碱的作用RNA链在延长过程中形成一个新的磷酸二酯键，因此在合成的第二步—转位时鹅膏蕈碱在原来多用基础上，使酶和模板DNA及新生RNA形成一种三元络合物从而使酶的催化部位受阻，不能合成新的mRNA〔3〕导致细胞死亡。 本实验中鹅膏蕈碱对C6胶质瘤細胞也呈现慢作用毒性。鹅膏蕈碱12和24 h组由于作用时间太短不同浓度间作用效果区别不大，结果不理想48 h组和72 h组由于作用时间较长，鹅膏蕈碱对细胞呈现了一定规律的毒性作用这种毒性随着浓度增大而增强。由于72 h作用时间更长所以鹅膏蕈碱对细胞的破坏也更大，作用效果也更明显浓度越大，细胞坏死的越多鹅膏蕈碱对细胞的毒性作用由于时间加长而增大。且鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞作用一定的时间后对C6胶质瘤细胞的抑制作用随浓度增加而增加，呈现浓度依赖性 【

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